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Competent cell 만들기
송 지 영
0. 만들기 전 준비
centrifuge bottle×4
eppendorf tube
buffer TfB Ⅰ
TfB Ⅱ
—————–> , 은 4℃ 보관
media(TYM)
20㎖x2 in 250㎖ flask
100㎖x2 in 2ℓflask
500㎖x2 in 500㎖ bottle
3㎖x2 in deep vial
—————–> media는 하루 전 만들어 37℃에 보관
rack
dry ice, 공업용 알콜
Ⅰ. 만들기(500㎖x2 : 1ℓ기준) ; 모든 step은 sterile condition!
day0 : LB plate에 만들 strain을 streak 하여 0/n배양한다.
day1 : 1. Cell 접종(3-4개 큰 colony를 15㎖짜리 tube의 3㎖ LB에 접종한다.
2. 2-3시간 후 250㎖ flask의 20㎖ TYM media에 넣고 배양한다.
3. 2-3시간 후 2ℓ flask의 100㎖로 옮겨서 배양한다.
4. 2-3시간 후 500㎖ bottle의 media를 전부 부은 후 O.D가 약 0.3이 될 때 까지 배양한다. (조건에 따라 6시간 정도 걸림)
(★ ice에서 cell을 충분히 식힌다. – 5분 정도 flask를 돌리면서)
5. centrifuge. 3500rpm, 7’( 한일 )
6. TfBⅠ buffer를 500㎖당 100㎖씩 을 넣은 후 ice에서 suspend.
(천천히, 손으로, vortex 절대금지)
7. centrifuge. 3500rpm, 5’( 한일 )
8. TfBⅡ를 500㎖당 20㎖씩 첨가한다.
9. Cold room에서 준비된 ependorf tube에 0.2㎖씩 분주한다.
*분주 즉시 준비된 dry ice+공업용 알코올(-70℃)에 넣는다.
10. -70℃에 보관한다.
★ step 4-5에는 coldroom에 autoclave된 ependorf tube를 rack에
미리 꽂아 두어야한다.
★ step 7-8에는 dry ice를 공업용 알코올을 부어 준비한다.
Ⅲ. Efficiency 측정
1. 농도를 알고 있는 DNA를 competent cell 100λ에 넣는다.
(1-5㎕ x ng)
2. ice에서 30분
3. 42℃에서 1분
4. ice에서 2분
5. LB 1㎖을 넣은후 37℃에서 1시간
6. LB +amp에 20λ깔기
7. Colony수 (N) 계산
Ⅲ. Efficiency 계산
N CFU x 1000ng/Xng x 1100㎕/20㎕ = cfu/㎍DNA
TYM media (1240ml)
2% Bacto Tryptone
24.8g
0.5% Yeast Extract
6.2g
0.1M NaCl
7.25g
10mM MgSO4+ 7H2O
3.06g
★TfBI buffer
30mM KOAc
1.45g
50mM MnCl₂+4H2O
4.95g
100mM KCl
3.73g
10mM CaCl₂+2 H2O
0.74g
15% glycerol
75ml
⇒반드시 filtering (no autoclave)
★TfBⅡ buffer( 500ml)
10Mm Na-Mops
1.05g
75mM CaCl₂+ 2H2O
5.5g
10mM KCl
3.734g
15% glycerol
75ml
반드시 autoclave ,pH7.0
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