[박상규] Tube Formation Assay

[Anonymous]

Tube Formation Assay

                          2004.11.09          Arthur

 

1.     24well plate를 ice위에 놓는다.

2.     Gel (matriegel, Collagen gel) 300-400ul를 ice상에서 24well에 넣어 골고루 퍼지게 가볍게 흔든 뒤, 37°C에서 30분간 굳힌다.

-Matrigel은 상온에서 굳기 시작하므로 사용 시 주의. 반드시 ice에서 작업.

–흔들어서 골고루 퍼지지 않으면 tip끝으로 골고루 퍼지게 한다.

이때 bubble이 생기지 않게 주의

–          48well 사용시 matriegel 100-150ul사용

3.     gel이 굳으면 gel위에 cell을 적당량 심어준 뒤 37°C에서 incubation

-gel 을 굳힐 때 cell trypsinization & counting

–          cell 양 (24 well 기준) : BAEC : 2X10⁵/well

HUVEC: 4X10⁵/well

        -control에서의 tube 형성 정도에 따라 cell의 양 조절

        -24 well 일 때 배지의 volume은 1ml이 되게 한다.

        -cell은 gel위에 골고루 퍼지게 한다.

        *** tube formation을 관찰할 때는 cell resuspension시에 5% FBS를 사용하고 tube formation inhibition을 관찰할 때는 20% FBS를 사용한다.***

        *** 약물은 cell 을 seeding 할 때 배지와 같이 섞어 넣는다. ***

        *** 굳힌 gel은 충격에 민감하기 때문에 cell이 잘 퍼지게 흔들 때 조심해서 흔든다. 또한 pippet을 이용하여 cell 을 분주 할 때 너무 세게 분주하면 이 또한 gel의 crack을 유도할 수 있기 때문에 벽을 통해 천천히 분주한다. ***

4.     시간변화에 따라 모양의 변화를 관찰한다.

-1시간 단위로 관찰, tube가 형성되었다가 사라지기도 함.

–보통은 6시간 뒤에 현미경 촬영

–현미경 관찰은 tube가 끊어지는 여부를 주의깊게 관찰한다.

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