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June 2, 2008 at 11:49 am #19003
Seung Jae JeongParticipantImmunohistochemical staining
I.0.01M Citrate Buffer antigen recovery (pH 6.0)
(From Zymed hightemperature Antigen Recovery Method, 8.21.96)
►반드시 coating된 slide를 사용할 것.
►Materials
A. 0.1M Citric Acid Sol.: 21.0g Citric Acid, monohydrate (C6H8O7-H2O)/1L DW
B. 0.1M Sodium Citrate Sol: 29.4g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7-
2H2O)/1L DW
ⓐ 9ml + ⓑ41ml +450ml DW/500ml
ⓐ 5.4ml + ⓑ24.6ml +270ml DW/300ml
⇒0.01M Citrate Buffer는 꼭 pH 6.0으로 만들어서 쓴다.
► Procedure
1. Xylene I, II, III——————————— 5min X 3
2. Acetone———————————– 4~5times dipping
3. EtOH 100% I, II,III——————————- 5min X 3
4. EtOH 90%⇒80%⇒70%———————– 5min respectively
5. 4~5 times tap water 갈아주기
6. Tap water—————————————— 5min
7. 4~5 times DW로 헹궈준 후
8. DW————————————————- 5min
☞수증기 증발을 막을 수 있는 chamber, slide놓는 받침대 준비.수평확인)
9. 1XPBS washing———————————— 5min X 3
☞조직이 마르면 안됨.D.W를 washing해주는 게 아주 중요–
PBS로 충분히 Washing!!
10. 3% H2O2 in MeOH quenching————————– 10min
(Endogenous peroxidase activity can be quenched by treating tissue sections with 3% hydrogen peroxide in absolute methanol-Ab를 발색 시킬 때 peroxidase 때문에 전체적으로 염색이 된다.)
☞staining jar에 solution 채운 후 slide rack에 slide를 꽂아서 10min.
11.tap water로 3번 wash.
12. D.W로 3번 wash.
13. slide뒷면에 name pen으로 marking
14. 1 X PBS washing—————————————————— 5min X 3
15. vacuum으로 PBS를 soaking
16.Pepsin————————————————————– 5min, RT.으로도 가능.
Stock
100㎕
800㎕
25% pepsin
10%(1/40)
2.5㎕
20㎕
0.1M HCl
35%
0.89㎕
7.12㎕
1 X PBS
96.61㎕
772.88㎕
☞ Pepsin digestion : for Ag Recovery
1) PNAS vol.94, 14689.97’ 0.3% pepsin (sigma) in 0.0lM HCl, 5’at RT
2) Cell vol.97.703. 99’ 0.25% pepsin (sigma) in 0.1M HCl, 2’ at RT
16. 1 X PBS washing ——————————————————- 5min X3
17. Boiling in 0.01M citrate buffer ————————————– 10min
(500ml buffer 사용 시 15min boiling. 5min이 지나야 끓기 시작하므로 5min 후 10min boiling되는 것을 기준으로 함.)
18. Cooling at R.T———————————————————–> 10min
(ice에서 빨리 식혀도 된다. 너무 뜨겁지 않을 정도로 식혀준다.)
19.1 X PBS ——————————————————————- 5min X 3
TM kit> Cat. No. 95-9541
20. 100㎕ blocking Sol. (Reagent 1A)——————-30 min
(조직을 덮을 만큼만 사용한다. )
21. 3rd DW washing ——————————————————– 5min X2
22. 100㎕ blocking Sol. (Reagent 1B)——————-10 min
23. 3rd DW washing ——————————————————– 5min X2
24. 1 X PBS washing I, II, III ——————————————–5min respectively
25. 1:100 dilutions 1st Ab (with 1%BSA+PBS)——————- O/N in M. chamber.
1)목적
Ab
Tissue
Vol.
혈관형성
Anti-PECAM1
(Platelet endothelial cell adhesion molecule)
Scapula
⇒100㎕
Cell proliferation
Anti-PCNA
E 15.5 day
⇒100㎕
Screening
Anti-p43
E 15.5 day
⇒100㎕
2)1st Ab solution 300㎕만들기Working
Stock
300㎕
1% BSA
5% BSA
60㎕
5% CAS
100% CAS
15㎕
1 X PBS, pH 7.4
225㎕
3)epp.tube에 100㎕씩 aliquot한 후 각 tube에 Ab를 1㎕(X1/100)씩 addition.
26.1XPBS washing I, II, III ————— 5min respectively
27.100㎕ 2nd Ab*B (Reagent 1C) ——————- 20min 이상.
28.1 X PBS washing I, II, III ————– 5min respectively
29. 100㎕ Enzyme conjugate (Reagent2)————- 10min
30. 100㎕ Substrate-Chromogen mixture —————– 10min
(Mixing Method : 5㎕ 3A +| 5㎕ 3B + 5㎕ 3C + 100㎕ DDW)
☞색깔의 변화를 지켜 보다가 빨갛게 색이 변하면 D.W로 바로 washing.
l Use mixing sol. Within 1hr
31. 3rd DW washing————————————————————- 2min X2
32. 100㎕ Hematoxyline (Reagent 4)——————– 1~3 min
33. 3rd DW washing ———————————– 2min X2
34. Putting slides into PBS until blue (approx. 10min)
35. 3rd DW washing ———————————- 2min X 2
36. .100㎕ GVA mounting with cover slip
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