Purification of aaRS Complex from Bovine Liver (국문)

[Seung Jae Jeong]

Purification of aaRS Complex from Bovine Liver

 

 

1. fresh liver를 썰어 protease inhibitor가 들어 있는 buffer 1에서 먼저 핏물을 제거한다. 이 과정을 약 5회 정도 반복한다. 그런 다음 다시 잘게 썰어(다지듯이) g 당 3ml의 buffer 1을 넣어 homogenizer(PowerGen 700)를 이용 level 1로 약 20초간 파쇄한다. 다시 1분 후 10초간 파쇄하는 과정을 5회 반복한다. 다음 level 4에서 20초간 파쇄한 다음 2분 후 다시 20초간 파쇄하는 과정을 5회 반복한다.

 

2. 파쇄된 lysate를 26,000Xg에서 45분간 원심분리를 하여 tissue debirs를 제거하고 난 supernatant를 다시 100,000Xg 로 1시간 동안 초 원심분리를 하여 post ribosomal protein을 얻는다. 이것을 crude lysate라고 한다. 얻어진 crude lysate의 농도를 bradford method를 이용하여 측정한다.

 

3. 얻어진 crude lysate에 50% PEG 6000(Fluka) solution을 최종적으로 2%가 되도록 한번에 crude lysate volume의 1/100으로 나누어 2분 간격으로 떨어뜨리고 천천히 stirring 한다. 최종적으로 2%가 되게 녹인 다음 30분동안 계속 stirring 한다.

 

4. 2% PEG 6000으로 녹여진 crude lysate를 12,000Xg에서 20분간 원심분리한다.

 

5. supernatant 만을 취하여 최종 농도가 10%가 되게 3번의 방법과 같이 50%PEG 6000 solution을 천천히 stirring 하면서 녹인다음 30분간 계속 stirring 한다.

 

6. 4번과 같은 방법으로 원심분리하여 pellet을 취한다.

 

7. 이 pellet을 buffer 1 에 resuspension하여 0.4um filter를 이용하여 filtering한다. filtering 한 lysate를 다시 buffer 1에 Dialysis한다.

 

8. Dialyzed 된 lysate를 미리 buffer 1으로 equilibration된 DEAE Sephacel에 0.8ml/min의 유속으로 binding 시킨다.

 

9. Binding시킨 다음 20배 volume의 buffer 1 으로 column을 wash한 다음 0mM에서 500mM의 NaCl gradient를 bed volume의 10배로 걸어주고 fraction을 8ml씩 받는다.

 

10. IRS의 activity를 나타내는 fraction들을 모아 농도를 측정하고 buffer 1으로 dialysis하여 30mg/ml로 농축한다.

 

11. 미리 2배의 bed volume의 buffer 1으로 equilibration된 Bio Gel A-5m(Bio Rad)에 loading하고 0.6ml/min으로 running하고 fraction을 5ml 씩 받는다.

 

12. 각각의 fraction 들을 IRS에 대하여 activity를 측정하여 IRS activity를 보이는 fraction들을 모아 buffer 1으로 equilibration된 Blue Sepharose(Bio Rad)에 0.8ml/min 으로 running한다. Bed volume의 20배로 washing 한 다음 bed volume의 10배로 0mM에서 1.3M까지 KCl gradient를 걸어준다.

 

13. 각각의 fraction들을 IRS에 대하여 activity를 측정하여 IRS activity를 보이는 fraction들을 모아 buffer 1으로 dialysis한다. 미리 buffer 2로 equilibration된 Hydroxyapatite에 0.6ml/min의 유속으로 binding시킨다. bed volume의 20배로 washing한 다음 100mM에서 400mM까지 phosphate gradient를 bed volume의 10배로 걸어준다. fraction은 4m씩 받는다.

 

14. IRS의 activity를 보이는 부분들을 모아 buffer 1으로 dialysis한 다음 buffer 1으로 equilibration 한 Heparin Sepharose에 0.4ml/min으로 binding 시킨다. bed volume의 20배로 washing 한 다음 0mM에서 400mM까지 KCl gradient를 주어 elution 한다.

 

15. IRS activity를 보이는 부분들을 모아서 dialysis한 다음 농축하여 SDS-PAGE을 건다.

 

 

 

 

*******************IMPORTANT NOTE****************

 

 

1. All procedures must be performed at 4 degree

2. Use fresh protease inhibitor cocktail

3. Do not delay the Time. This full procedures will take about 2 weeks if without stop

4. All kinds of buffers must be 0.2um filtered and degassed.

5. You have to use at least 2 folds buffer of bed volume for column equilibration

 

 

Buffer 1.

25mM KPO4, pH 7.5, 10% glycerol, 0.1mM EDTA, 10mM β-Mercaptoethanol

 

DEAE Gradient buffer

buffer 1 + 500mM NaCl

 

Blue Sepharose Gradient buffer

Buffer 1 + 1.3M KCl

 

Hydroxyapatite equilibration buffer

100mM KPO4, pH 7.5, 10% glycerol, 0.1mM EDTA, 10mM β-Mercaptoethanol

 

Hydroxyapatite Gradient buffer

400mM KPO4, pH 7.5, 10% glycerol, 0.1mM EDTA, 10mM β-Mercaptoethanol

 

Heparin Gradient buffer

buffer 1 + 400mM KCl

 

50% PEG 6000 Sol

Buffer 1 + 50% PEG 6000

 

Protease Inhibitor cocktail(1000X)

5mg/ml Pepstatin A, 5mg/ml Leupeptin, 5mg/ml Antipain, 5mg/ml Chymostatin

=> must be melted at DMSO=>store at -20 degree

=> use 1X

 

Benzamidine Stock Sol(1M)

=> must be melted at buffer 1 => store at -20 degree

=> use 1mM

 

PMSF Stock Sol(100mM)

=> must be melted at Isopropyl alcohol => store at -20 degree

=> use 0.1mM

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