[민유홍] Purification of YRS and KRS

[Seung Jae Jeong]

Purification of YRS and KRS

1.     10ml ON culture을 1l LB broth에 접종 후 OD600  0.5가 될 때까지 배양한다.

2.     IPTG 0.1mM 되도록 넣은 후 18C 에서 ON 배양한다.

3.     cell harvest 한 후 buffer A (20mM KH2PO4 pH 7.8, 500mM NaCl, 2mM b-mercaptoethanol, 10% glycerol) 30ml에 resuspension한 후 ultra-sonicator (Fisher)를 이용하여 3초 가한 후 27초 쉬고, total 3분간 강도 6~7로 sonication한다.

4.     26000 Xg로 4C, 45분간 centrifugation한다. Buffer A 로 equilibration한 nickel column (bead vol. 2ml)에 supernatant를 가한 후 buffer A로 washing한다.

5.     Buffer A pH 6.0, buffer A pH 5.2로 순서대로 washing한 후 buffer A pH 6.0 25mM imidazole로 washing한다.

6.     buffer A pH 6.0 200mM imidazole로 elution한다.

7.     50mM HEPES pH 7.5, 2mM b-mercaptoethanol, 1mM EDTA, 50% glycerol으로 dialysis한다.

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