[molecular biology work] gel_filtration_protocol-short

[Seung Jae Jeong]

◈ gel filtration  

 

1.     p43,p38,wild type의 MEF cell을 100π dish 20장에 culture(37℃ CO2 5%).

2.     TE처리후 cold 1XPBS로 spindown 하고, 다시 한번 cold 1XPBS로 washing한다.

3.     hypotonic solution(10mM HEPES pH7.6, 10mM KCL, 1.5mMMgCl2, 0.5mM EGTA, 10mM NaF, 1mM PMSF, Protease  inhibitor cocktail<Roche> )과 syringe(needle size 23G)로 lysis 시킴.

4.     4℃, 14000 rpm에서 15min간 centrifuge.

5.     동일 volume의 solution(10mM HEPES pH7.6, 150mM KCL, 1.5mMMgCl2, 0.5mM EGTA, 10mM NaF, 1mM PMSF, Protease  inhibitor cocktail<Roche> )을 첨가해서 80mm KCl solution으로 만든다.

6.     9mg/ml로 vivaspin(VIVASCIENCE)을 이용하여 농축 시킨다. 0.22um filter로 filtering을 한 후 단백질 농도를 잰다.

7.     (10mM HEPES pH7.6, 80mM KCL, 1.5mMMgCl2, 0.5mM EGTA, 10mM NaF, 1mM PMSF, Protease  inhibitor cocktail<Roche> ) buffer로 FPLC pump와 column(Pharmacia, Sephacryl S-300 High resolution, separate range 10Kda-1500KDa )을 equilibrium 시킨다.

8.     sample 500ul(4mg/500ul) injection 후 flow rate 1.0ml/min, fraction size 1ml로 gel filtration program을 4℃ 돌린다.

9.     일부 fraction을 취해서 western blotting을 한다.

 

 

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