[박상규] NRS purification

NRS E.Coli induction

 

1.     4 ml LB배지에 E. Coli colony를 접종하고 kanamycin (25ug/ml)을 넣고 O.D.가 0.6 이상이 될 때까지 37℃ shaking incubator에서 키운다.

2.     1L LB 배지(+kanamycin)에 1번의 배지를 다 넣어서 37℃ shaking incubator에서 키운다. O.D. 1.5정도가 될 때까지.

3.     IPTG 1mM이 되도록 IPTG를 넣고, 12hr, 23℃에서 incubation 시킨다. 이 때, IPTG를 넣기전 1ml의 media를 취하여 14000rpm, 3 min centrifuge한다(a) (-20℃에 보관한다.)

4.     3000rpm, 15min, 4℃에서 centrifuge한다. Pellet만 모아 무게를 확인한다.

=> 1ml의 media를 취하여 14000rpm, 3 min centrifuge한다(b) (-20℃에 보관한다.)

5.     pellet을 -70℃에서 보관한다.

6.     1ml씩 취한 sample을 이용하여 NRS induction을 확인한다.

1.     (a), (b)의 sample을 0.5ml의 D.W.에 resuspension하여 ice에 넣은 뒤, cell을 sonicator로 깬다. 10초씩 4번 정도

2.     Induction 안 시킨 sample만 14000rpm, 5min, 4℃에서 centrifuge하여 supernatant & pellet으로 분리. Pellet은 D.W. 0.5ml에 resuspension.

3.     5X sample buffer(전체 vol의 1/4 만큼) 넣어주고, 10min, 100℃ heating한다.

4.     10% SDS gel로 induction 확인한다.

 

NRS Purification

 

1.     -70℃에서 보관 중인 pellet을 녹인다.

2.     pellet 1g당 5ml의 50mM Tris, 50mM NaCl, pH 7.8 buffer로 resuspension 하여 비커에 넣는다.

3.     비커를 얼음에 잘 박아두고, sonication 6-8min (2초씩 15초씩 휴식)

4.     12000rpm, 30min, 4℃으로 centrifuge

5.     supernatant만 모아서 4도에서 Ammonium sulfate precipitation(fine grinded powder)하였다. 각각 %로 saturation시킨 후 30분간 stirring.

20%, 35%, 50% 으로

Centrifuge는 12000rpm, 20 min, 4℃ è 35%와 50%사이에서 NRS는 precipitation된다.

6.     10% SDS gel로 fraction 확인한다.

( input, 20% , 35%, 50%, supernatant)

7.     Dialysis 2L씩 4번 with SP- sepharose buffer

(100mM NaCl, 50mM Tris-HCl, 15% glycerol, 0.5mM EDTA, 2mM ß-mercapto ethanol , pH 7.4)   -> 이때 2-3번째 dialysis 때, protein이 뭉치는 현상을 볼 수 있다. 14000rpm, 20min, 4℃ centrifuge하여 pellet을 분리 한다. Gel 걸어서 pellet을 확인한다.

8.     Dialysis 후의 sample의 protein 농도를 확인한다. ( Bradford assay)

9.     Ion-Exchange column 통과 시킨다.

l  Buffer A : 50mM Tris- HCl

              100mM NaCl

              10% glycerol

              0.5mM EDTA

              2mM ß-mercapto ethanol

              pH 7.4

l  Buffer B : Buffer A 와 700mM NaCl 빼고는 모두 동일.

l  Protein의 양에 따라 resin packing 하고, buffer A로 equilibriate 한다. (100ml 정도의 buffer를 통과시킨다.)

l  Protein loading 한다. (1ml/min)

l  Buffer A 로 column washing ( 200ml)

l  Buffer A & B로 gradient 만든다.

l 

1.5ml/min 60min

Buffer B

Buffer A

l  Fraction을 받아 (6ml씩) gel 걸어 NRS가 있는 fraction 확인

10.  NRS 가 있는 fraction만을 모아서 dialysis 한다. ( 3 times with each 2L)

50mM Tris

80mM NaCl

2mM ß-mercapto ethanol

10% glycerol

pH 7.5 buffer로…

11.  Dialysis 후 protein의 농도를 확인한다. ( Bradford assay)

12.  Heparin Column을 통과 시킨다.

l  Buffer A : 50mM Tris

              80mM NaCl

             2mM ß-mercapto ethanol

10% glycerol

pH 7.5

l  Buffer B : 50mM Tris

              500mM NaCl

2mM ß-mercapto ethanol

10% glycerol

pH 7.5

l  Protein의 양에 따라 resin packing

l  Buffer A로 resin equilibriate한다. ( 100ml 정도)

l  Protein loading (1ml/min)

l  Resin washing with buffer A (200ml)

l 

1.5ml/min 30min

Buffer B

Buffer A

l  Buffer A & B 로 gradient 넣어준다.

l  Fraction (6ml씩) 받는다. Gel 걸어 NRS 가 들어있는 Fraction을 확인한다.

13.  Dialysis 후의 protein 농도를 확인한다. (Bradford assay)

14.  NRS가 있는 Fraction만을 모아서 dialysis한다. 2L씩 3번

    20mM KH2PO4

    500mM NaCl

2mM ß-mercapto ethanol

pH 7.8

15.  Ni-column을 통과시킨다.

l  Protein 양에 따른 resin을 packing한다.

l  pH 7.8 buffer로 equilibriate

l  protein loading

l  pH 7.8 buffer 로 washing (1L)

l  pH 6.0 buffer 로 washing (1L)

l  pH 5.2 buffer 로 washing (1L)

l  50mM Imidazole(pH 6.0 buffer) 로 washing (O.D. 0 에 가까워질 때까지)

l  300mM Imidazole(pH 6.0 buffer) 로 Elution

16.  NRS가 들어있는 Fraction 모아 dialysis. 2L x 3

20% glycerol , 250mM NaCl PBS

17. Mustang membrane으로 filtration

 

NRS LPS 농도		6070.288	EU/ml
NRS 농도		0.55796	mg/ml