[안영하] Isolation_of_Genomic_DNA_using_vaccutainer

Isolation protocol for Genomic DNA(mouse knock out. +/+, +/- and -/-)

 

mouse tail cutting한 후, 그 날 PK를 처리하지 않을 경우 -70°C에 저장.

1.PK treatment: TES(500ml)+PK(100~200mg=20ml )/tail 1cm ,55°C,O/N ,

*PK농도는 sample종류에 따라 조절

*60°C 이상시 PK가 파괴되므로 절대 넘지 않도록, Water bath는 미리

55°C로 setting해놓는다. PK는 녹여서 잘 shaking한 후에 사용한다

 

2.PK처리한 꼬리 녹은 용액 전부를 vacutainer에 붓는다.

3.add  PCIA 500ml.(PCIA=Amerscom.)

4.mix gently up and down(뿌옇게 될 때까지 10회한다. 너무 많이 세게하면 DNA가 깨짐)

5.centrifuge 2000rpm,10min, DNA는 반드시at R.T

4,5,6의 과정을 두 번 되풀이한다.

6.add CIA 500ml(chloroform:isoamyl alcohol=24:1)

7.mix gently up and down(뿌옇게 될 때까지 10회, 너무 많이 세게하면 DNA 깨짐)

8.centrifuge 2000rpm,10min, at R.T에서 반드시

*7,8,9의 과정을 두 번 되풀이 한다.

9..상층액을 E.tube에 살짝 붓는다.

10.add cold 100% EtOH 700ml  *place 100% EtOH on ice

11.mix gently up and down

l  gently hand-mixing to precipitate DNA and incubating 5min at Room temp. to        complete precipitation,. PCR시에는 바로 넘어가도 무방하다. 그러나 southern시에는 DNA가 많이 필요하므로 방치 필요.

l  이때 하얀 실타래 같은 DNA가 보인다.

12..yellow tip으로 DNA를 말아 건진 후 100% EtOH를 살살 털어낸 후 거꾸로 세운다.

13.cold 70% EtOH 300~400ml정도로 tip 끝의 DNA를 충분히 washing한다.

     *70% EtOH 처리 시에는 신속하게 작업하는게 좋다. Otherwise, DNA가 

      녹아버린다.

    

14.70%EtOH를 조심스럽게 털어낼 것.

15.drying 10min at R.T(tip안 쪽의 EtOH를 조심, 너무 하얗게 완전히 말리지 말 것, DNA가 잘 안 녹는다.)

16.200ml D.W에 tip끝을 넣어 gently tapping (pellet이 떨어지는 것이 보인다.)

17.dissolving DNA at water bath 55°C, 1-2hr(or 37~55°C, O/N),완전히 녹일 것

19DNA quantitation by UV spectrometer.(밑의 자료 참고)

-DNA2ml +DW 198ml (1/100 dilution).

-add 200ml into spec. cell

-reading

-calculating: DNA conc& Ratio check

 

[For southern]

20ml digestion

enzyme=100 unit 3-4hr digestion

→Add 1-2ml enzyme

→gently tapping & O/N

→500ng mini gel running digestion confirm

→after complete digestion

→large gel running

→Southern

20.storing in -20°C, if you stop your step.

 *DNA가 깨지지 않도록 모든 step 조심해줄 것