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June 2, 2008 at 11:49 am #19007
Seung Jae JeongParticipantIsolation protocol for Genomic DNA(mouse knock out. +/+, +/- and -/-)
mouse tail cutting한 후, 그 날 PK를 처리하지 않을 경우 -70°C에 저장.
1.PK treatment: TES(500ml)+PK(100~200mg=20ml )/tail 1cm ,55°C,O/N ,
*PK농도는 sample종류에 따라 조절
*60°C 이상시 PK가 파괴되므로 절대 넘지 않도록, Water bath는 미리
55°C로 setting해놓는다. PK는 녹여서 잘 shaking한 후에 사용한다
2.PK처리한 꼬리 녹은 용액 전부를 vacutainer에 붓는다.
3.add PCIA 500ml.(PCIA=Amerscom.)
4.mix gently up and down(뿌옇게 될 때까지 10회한다. 너무 많이 세게하면 DNA가 깨짐)
5.centrifuge 2000rpm,10min, DNA는 반드시at R.T
4,5,6의 과정을 두 번 되풀이한다.
6.add CIA 500ml(chloroform:isoamyl alcohol=24:1)
7.mix gently up and down(뿌옇게 될 때까지 10회, 너무 많이 세게하면 DNA 깨짐)
8.centrifuge 2000rpm,10min, at R.T에서 반드시
*7,8,9의 과정을 두 번 되풀이 한다.
9..상층액을 E.tube에 살짝 붓는다.
10.add cold 100% EtOH 700ml *place 100% EtOH on ice
11.mix gently up and down
l gently hand-mixing to precipitate DNA and incubating 5min at Room temp. to complete precipitation,. PCR시에는 바로 넘어가도 무방하다. 그러나 southern시에는 DNA가 많이 필요하므로 방치 필요.
l 이때 하얀 실타래 같은 DNA가 보인다.
12..yellow tip으로 DNA를 말아 건진 후 100% EtOH를 살살 털어낸 후 거꾸로 세운다.
13.cold 70% EtOH 300~400ml정도로 tip 끝의 DNA를 충분히 washing한다.
*70% EtOH 처리 시에는 신속하게 작업하는게 좋다. Otherwise, DNA가
녹아버린다.
14.70%EtOH를 조심스럽게 털어낼 것.
15.drying 10min at R.T(tip안 쪽의 EtOH를 조심, 너무 하얗게 완전히 말리지 말 것, DNA가 잘 안 녹는다.)
16.200ml D.W에 tip끝을 넣어 gently tapping (pellet이 떨어지는 것이 보인다.)
17.dissolving DNA at water bath 55°C, 1-2hr(or 37~55°C, O/N),완전히 녹일 것
19DNA quantitation by UV spectrometer.(밑의 자료 참고)
-DNA2ml +DW 198ml (1/100 dilution).
-add 200ml into spec. cell
-reading
-calculating: DNA conc& Ratio check
[For southern]
20ml digestion
enzyme=100 unit 3-4hr digestion
→Add 1-2ml enzyme
→gently tapping & O/N
→500ng mini gel running digestion confirm
→after complete digestion
→large gel running
→Southern
20.storing in -20°C, if you stop your step.
*DNA가 깨지지 않도록 모든 step 조심해줄 것
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