[안영하] in_vivo_Matrigel_plug_assay

in vivo Matrigel plug assay

 

1.  6-7 주령의 male mouse를 사용한다.

2. 준비 시약

  – Matrigel@basement membrane matrix

    (Becton Dickinson, Cat. No: 354234)

– Heparin (Sigma, Cat. No: H3149): 9u/ml

50,000unità5ml(1Xsterile PBS)로suspensionà10,000u/ml stock.(10u/ul) at –20⁰C

사용 시 1XPBS/BSA(1mg/ml)로 1/10 dilution해서 사용—1unit/1ul.

– bFGF (upstate, Cat. No: 01-106): 100ng/ml

    25ug/25ul stock—사용 시마다, serum free media로 1/100 dilution à10ng/ul

–          tip과 tube등을 미리 -4⁰C에 보관해두기

3. Matrigel은 4℃에서 서서히 녹인다 (하루 전에 녹여 놓음).

4. Positive control: Matrigel + bFGF (100ng/ml) + heparin (9U/ml) —8U/ml루,,,

  Negative control: Matrigel + heparin (9U/ml) ——– 8unit/ml로 사용할 것.

  (주의: Matrigel은 4℃보다 온도가 올라가면 굳으므로 모두 ice 상에서 섞어줄 수 있도록 한다. 그리고 sample당 final volume 700ul 씩 되도록 계산한다.)

5. 4번에서 명시한대로 sample을 준비 후,sample을 mix한 후, vortex.

àspin down at 4⁰C, à주사기 앞 바늘(25gauge)도 ice에 미리 박아둔다.à700ul를 취한 후, 1ml syringe로 Matrigel 500ul가 mouse의 subcutaneous로 주입되도록 한다. (마취 후에 복부의 털 깎기. )

6. 5일 ~ 7일 후 Matrigel plug 만을 취한 후,

  – Hemoglobin assay를 실시한다.

–          또는 block을 만들어 section하여 HE staining을 한다.

7. Skin제거하고 E.tube에 Matrigel을 넣는다.

(on ice에서 하면 더 좋겠지만…상온에서 E.tube에 넣음.)

8. D.W 500ul를 넣고, 가위로 chopping.(D.W양은 조절해가면서,,)

9. Block을 만들 때는 skin을 제거하지 말아야 함. (paraffin block 제작할 것)