[안영하] Immunohistochemical_staining

Immunohistochemical staining

 

I.0.01M Citrate Buffer antigen recovery (pH 6.0)

(From Zymed hightemperature Antigen Recovery Method, 8.21.96) 

 

►반드시 coating된 slide를 사용할 것.

►Materials

A.    0.1M Citric Acid Sol.: 21.0g Citric Acid, monohydrate (C₆H₈O₇-H₂O)/1L DW

B.     0.1M Sodium Citrate Sol: 29.4g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7-              

2H2O)/1L DW

 

    ⓐ 9ml  +  ⓑ41ml  +450ml DW/500ml

    ⓐ 5.4ml  + ⓑ24.6ml  +270ml DW/300ml

⇒0.01M Citrate Buffer는 꼭 pH 6.0으로 만들어서 쓴다.

► Procedure

1. Xylene I, II, III——————————— 5min X 3

2. Acetone———————————– 4~5times dipping

3.      EtOH 100% I, II,III——————————- 5min X 3

4.      EtOH 90%⇒80%⇒70%———————– 5min respectively

5.      4~5 times tap water 갈아주기

6.      Tap water—————————————— 5min

7.      4~5 times DW로 헹궈준 후

8.      DW————————————————- 5min

☞수증기 증발을 막을 수 있는 chamber, slide놓는 받침대 준비.수평확인)

9.      1XPBS washing———————————— 5min X 3

☞조직이 마르면 안됨.D.W를 washing해주는 게 아주 중요–

PBS로 충분히 Washing!!

10.  3% H₂O₂ in MeOH quenching————————– 10min

(Endogenous peroxidase activity can be quenched by treating tissue sections with 3% hydrogen peroxide in absolute methanol-Ab를 발색 시킬 때 peroxidase 때문에 전체적으로 염색이 된다.)

☞staining jar에 solution 채운 후 slide rack에 slide를 꽂아서 10min.

11.tap water로 3번 wash.

12.  D.W로 3번 wash.

13.  slide뒷면에 name pen으로 marking

14.  1 X PBS washing—————————————————— 5min X 3

15.  vacuum으로 PBS를 soaking

16.Pepsin————————————————————– 5min, RT.으로도 가능.

	Stock	100㎕	800㎕
25% pepsin	10%(1/40)	2.5㎕	20㎕
0.1M HCl	35%	0.89㎕	7.12㎕
1 X PBS		96.61㎕	772.88㎕

 

 

 

 

 

☞ Pepsin digestion : for Ag Recovery

1) PNAS vol.94, 14689.97’ 0.3% pepsin (sigma) in 0.0lM HCl, 5’at RT

2)      Cell vol.97.703. 99’ 0.25% pepsin (sigma) in 0.1M HCl, 2’ at RT

 

16.  1 X PBS washing ——————————————————- 5min X3

17.  Boiling in 0.01M citrate buffer ————————————– 10min

(500ml buffer 사용 시 15min boiling. 5min이 지나야 끓기 시작하므로 5min 후 10min boiling되는 것을 기준으로 함.)

18.  Cooling at R.T———————————————————–> 10min

(ice에서 빨리 식혀도 된다. 너무 뜨겁지 않을 정도로 식혀준다.)

19.1 X PBS ——————————————————————- 5min X 3

TM kit>

     Cat. No. 95-9541

20.  100㎕ blocking Sol. (Reagent 1A)——————-30 min

(조직을 덮을 만큼만 사용한다. )

21.  3^rd DW washing ——————————————————– 5min X2

22.  100㎕ blocking Sol. (Reagent 1B)——————-10 min

23.  3^rd DW washing ——————————————————– 5min X2

24.  1 X PBS washing I, II, III ——————————————–5min respectively

25.  1:100 dilutions 1^st Ab (with 1%BSA+PBS)——————- O/N in M. chamber.

1)

목적	Ab	Tissue	Vol.
혈관형성	Anti-PECAM1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule)	Scapula	⇒100㎕
Cell proliferation	Anti-PCNA	E 15.5 day	⇒100㎕
Screening	Anti-p43	E 15.5 day	⇒100㎕

2)1^st Ab solution 300㎕만들기

Working	Stock	300㎕
1% BSA	5% BSA	60㎕
5% CAS	100% CAS	15㎕
1 X PBS, pH 7.4		225㎕

 

 

 

 

3)epp.tube에 100㎕씩 aliquot한 후 각 tube에 Ab를 1㎕(X1/100)씩 addition.

      26.1XPBS washing I, II, III ————— 5min respectively

27.100㎕ 2^nd Ab^*B (Reagent 1C) ——————- 20min 이상.

28.1 X PBS washing I, II, III ————– 5min respectively

29. 100㎕ Enzyme conjugate (Reagent2)————- 10min       

30.  100㎕ Substrate-Chromogen mixture —————– 10min

   (Mixing Method : 5㎕ 3A +| 5㎕ 3B + 5㎕ 3C + 100㎕ DDW)

☞색깔의 변화를 지켜 보다가 빨갛게 색이 변하면 D.W로 바로 washing.

l  Use mixing sol. Within 1hr

31. 3^rd DW washing————————————————————- 2min X2

32. 100㎕ Hematoxyline (Reagent 4)——————– 1~3 min

33. 3^rd DW washing ———————————– 2min X2

34. Putting slides into PBS until blue (approx. 10min)

35. 3^rd DW washing ———————————- 2min X 2

36. .100㎕ GVA mounting with cover slip