Immunocytochemistry

               

1.      Prepare the block of tissue or embryo: cryo-section prep.

A.    Fix tissue or embryo in 4% paraformaldehyde at 4⁰C for 2hrs or O/N.

4% paraformaldehyde는 잘 안 녹기 때문에 NaOH를 2~3방울(적당량)을 넣어 녹여준다.  조직을 4% paraformaldehyde에 incubation하는 time은 조직의 크기를 봐서 결정해야 한다. 15day embryo의 경우는 O/N, 보통은 2~4hr정도 incubation해준다. 너무 오래 담그면 조직이 굳기 때문에 주의.

B.     Incubate in 30%sucrose in PBS at 4⁰C for 1.5~4hrs

            Sucrose는 조직내의 물을 빼주고 OCT가 잘 침투하도록 해준다. 너무 오래 두면 조직이 변형되므로, 4hr를 넘기면안 된다.

C.    Cover the tissue or embryo with OCT compound: Miles thoroughly and store at -80⁰C

OCT에 기포가 안 들어가도록…주의

2.      frozen tissue section

3.      Make the coating slide …..그냥 사서 하는 게 낫지..

1)      sink in aceton

2)      Sink in 0.02%(v/v) Vectabond reagent (Vector laboratories)/ aceton for 5min

3)      Sink in DEPC D.W

4)       Dry at 50⁰C

4.        Reaction :HRP 방법을 쓸 때 (AP방법을 쓸 때는 다른 blocking regents를 써준다.)

1)      Bleached with 5% H₂O₂ for 10min to block endogenous peroxidase (in case of HRP)

원래 protocol에는 4hr처리이나 , 4hr 이상 처리하면 기포에 의해서 조직이 다 떨어져나감.

2)      Incubated in PBSTM for 2hr at R.T…. Blocking

Triton :0. 1%, skim milk: 1%, with PBS

             first Ab에 따라 skim milk를 넣는 게 조금씩 다르다. 4 ⁰C에서 하는 것 보다 R.T에서 하는 게 더 효과적.

3)      Treated with 10ug/ml of Ab in PBSTM at 4⁰C for O/N

이 때는 skim milk를 뺄 수 있다. 4⁰C에서 skim milk가 침전되면 별로 안 좋으니까.

1^st Ab는 상온에서 2hr 이상, 4⁰C에서 O/N을 해 주어야 함. 오래 주는 게 좋다.

4)      Washed with PBSTM for 20min, 5times at R.T.

Skim milk는 빼 주는 게  background를 낮게 해주겠지.

5)      Treated anti-2^nd antibody at 4⁰C for O/N.

상온에서 2hr 정도로도 Ok !.

6)      Repeat step 4)

7)      Color reaction with 3mg/ml 3 3’ diaminobenzen zidine, 0.5% NiCl₂, 0.03% H₂O₂  in PBS.

DAP(DAKO) 에 0.5% NiCl₂ 넣어서 사용.

Option으로 eosin을 처리하면, Smooth muscle cell은 purple로 staining되고 , PECAM은 brown으로 staining됨.

l  DAP, DAKO pen, pharmingen 1^st Ab.

 

 

Whole mount immunohistostaining

  

    The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45(6): 883-893, 1997

 

1.      Prefixed in 0.1M phosphate buffer

2.      Incubated in fixing sol.(methanol :dimethyl sulfoxide =4:1) for 2hrs to O/N

3.      Bleached (methanol :dimethylsulfoxide:30% H2O2 =4:1:1) for 2hr at R.T

100% MetOH에서 영구히 보존됨.

4.      80%à50à30% methanol with PBS 로 hydration.

5.      Blocked by incubating twice in PBSMT containing 1% normal goat serum and 0.2% BSA for 1hour at R.T                                                

                                            ( 2^nd Ab에 따라서 결정 )            

6.      Incubated with PBS MT containing 1^st Ab (0.5ug/ml) O/N

7.      Washed five times in PBSMT each for 1hr at 4 ⁰C for the initial three washes and at R.T for the final two.

8.      Developed by incubating 1ug/ml HRP-conjugated Ab O/N at 4⁰C.

9.      Washed with more than five exchanged of PBSMT including the final 20min wash n PBST at R.T

Skim milk가 들어가면 staining이 깨끗이 안되므로 마지막 wash때는 안 넣어준다.

10.  Soaked in PBST containing 0.05% NiCl2 and 250ug/ml diaminobensidine for 10`30min and hydrogen peroxide was added to 0.01%

    250ug/ml diaminobensidine대신 DAP사용.

11.  Rinsed three or four times in PBST

가볍게 dipping해서 rinse 하는 정도. 

12.  Dehydrated in 100% methanol and stored at -20⁰C until photographed.

30%à50%à80%à100% methanol with PBS로 dehydration.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Immunoassaying

By 문 은 정

I.                   –70⁰C에 있던 slide를 R.T에 3min 두면, OCT compound가 녹는다.

II.                PBS washing 5min, 3times.

III.             3% H2O2 with PBS —-10min 처리

R.T에서 tissue위에 3% H2O2를 두 번 연속 처리 후에 10min standing할 것.

Endogenous peroxidase를 inactivation시켜줌. 거품 발생.

IV.              PBS washing 5min, 3times

V.                 20mg/ml PK를 1/1000로 dilution해서 37⁰C에서 5min incubation.

VI.              PBS washing 5min, 3times

VII.           Blocking (3% BSA or skim milk with PBS), 20min

VIII.        PBS에 한 번 washing해주기

IX.               Primary Ab 처리.R.T, 2hrs.

Reaction은 ice위에서 해주고 0.2mg/ml Ab stock을 1/50(~1/500)으로 dilution해서 사용. With PBS.

Para film으로 밀봉해서 dry되지 않도록 한다.

X.                 PBS washing 5min, 3times.

XI.               secondary Ab 처리.  30min, R.T.

biotin이 달려있는 Ab를 사용. 농도는 보통 1:500.

XII.           PBS washig, 5min, 3times

XIII.        Streptavidin Peroxidase (1:500?)처리. 10min, R.T

(HRP)-àDAKO꺼.

XIV.        PBS washing 5min, 3times.

XV.           DAB 처리 10min, dark condition

Imidazole buffer( H2O2 포함.) 1ml

Chromogen (color reaction)  한 방울.

XVI.   Running water로 washing. àPBS로 washing àD.W washing.

 

àHematoxylin & eosin staining.

1.      Hematoxylin staining (핵 염색). 1min

2.      running water로 washing —àPBS로 washing—à running water로 washing

3.      mounting

http://www.vectorlabs.com/index.htm