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June 2, 2008 at 11:49 am #19001
Seung Jae JeongParticipantImmunocytochemistry
1. Prepare the block of tissue or embryo: cryo-section prep.
A. Fix tissue or embryo in 4% paraformaldehyde at 40C for 2hrs or O/N.
4% paraformaldehyde는 잘 안 녹기 때문에 NaOH를 2~3방울(적당량)을 넣어 녹여준다. 조직을 4% paraformaldehyde에 incubation하는 time은 조직의 크기를 봐서 결정해야 한다. 15day embryo의 경우는 O/N, 보통은 2~4hr정도 incubation해준다. 너무 오래 담그면 조직이 굳기 때문에 주의.
B. Incubate in 30%sucrose in PBS at 40C for 1.5~4hrs
Sucrose는 조직내의 물을 빼주고 OCT가 잘 침투하도록 해준다. 너무 오래 두면 조직이 변형되므로, 4hr를 넘기면안 된다.
C. Cover the tissue or embryo with OCT compound: Miles thoroughly and store at -800C
OCT에 기포가 안 들어가도록…주의
2. frozen tissue section
3. Make the coating slide …..그냥 사서 하는 게 낫지..
1) sink in aceton
2) Sink in 0.02%(v/v) Vectabond reagent (Vector laboratories)/ aceton for 5min
3) Sink in DEPC D.W
4) Dry at 500C
4. Reaction :HRP 방법을 쓸 때 (AP방법을 쓸 때는 다른 blocking regents를 써준다.)
1) Bleached with 5% H2O2 for 10min to block endogenous peroxidase (in case of HRP)
원래 protocol에는 4hr처리이나 , 4hr 이상 처리하면 기포에 의해서 조직이 다 떨어져나감.
2) Incubated in PBSTM for 2hr at R.T…. Blocking
Triton :0. 1%, skim milk: 1%, with PBS
first Ab에 따라 skim milk를 넣는 게 조금씩 다르다. 4 0C에서 하는 것 보다 R.T에서 하는 게 더 효과적.
3) Treated with 10ug/ml of Ab in PBSTM at 40C for O/N
이 때는 skim milk를 뺄 수 있다. 40C에서 skim milk가 침전되면 별로 안 좋으니까.
1st Ab는 상온에서 2hr 이상, 40C에서 O/N을 해 주어야 함. 오래 주는 게 좋다.
4) Washed with PBSTM for 20min, 5times at R.T.
Skim milk는 빼 주는 게 background를 낮게 해주겠지.
5) Treated anti-2nd antibody at 40C for O/N.
상온에서 2hr 정도로도 Ok !.
6) Repeat step 4)
7) Color reaction with 3mg/ml 3 3’ diaminobenzen zidine, 0.5% NiCl2, 0.03% H2O2 in PBS.
DAP(DAKO) 에 0.5% NiCl2 넣어서 사용.
Option으로 eosin을 처리하면, Smooth muscle cell은 purple로 staining되고 , PECAM은 brown으로 staining됨.
l DAP, DAKO pen, pharmingen 1st Ab.
Whole mount immunohistostaining
The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 45(6): 883-893, 1997
1. Prefixed in 0.1M phosphate buffer
2. Incubated in fixing sol.(methanol :dimethyl sulfoxide =4:1) for 2hrs to O/N
3. Bleached (methanol :dimethylsulfoxide:30% H2O2 =4:1:1) for 2hr at R.T
100% MetOH에서 영구히 보존됨.
4. 80%à50à30% methanol with PBS 로 hydration.
5. Blocked by incubating twice in PBSMT containing 1% normal goat serum and 0.2% BSA for 1hour at R.T
( 2nd Ab에 따라서 결정 )
6. Incubated with PBS MT containing 1st Ab (0.5ug/ml) O/N
7. Washed five times in PBSMT each for 1hr at 4 0C for the initial three washes and at R.T for the final two.
8. Developed by incubating 1ug/ml HRP-conjugated Ab O/N at 40C.
9. Washed with more than five exchanged of PBSMT including the final 20min wash n PBST at R.T
Skim milk가 들어가면 staining이 깨끗이 안되므로 마지막 wash때는 안 넣어준다.
10. Soaked in PBST containing 0.05% NiCl2 and 250ug/ml diaminobensidine for 10`30min and hydrogen peroxide was added to 0.01%
250ug/ml diaminobensidine대신 DAP사용.
11. Rinsed three or four times in PBST
가볍게 dipping해서 rinse 하는 정도.
12. Dehydrated in 100% methanol and stored at -200C until photographed.
30%à50%à80%à100% methanol with PBS로 dehydration.
Immunoassaying
By 문 은 정
I. –700C에 있던 slide를 R.T에 3min 두면, OCT compound가 녹는다.
II. PBS washing 5min, 3times.
III. 3% H2O2 with PBS —-10min 처리
R.T에서 tissue위에 3% H2O2를 두 번 연속 처리 후에 10min standing할 것.
Endogenous peroxidase를 inactivation시켜줌. 거품 발생.
IV. PBS washing 5min, 3times
V. 20mg/ml PK를 1/1000로 dilution해서 370C에서 5min incubation.
VI. PBS washing 5min, 3times
VII. Blocking (3% BSA or skim milk with PBS), 20min
VIII. PBS에 한 번 washing해주기
IX. Primary Ab 처리.R.T, 2hrs.
Reaction은 ice위에서 해주고 0.2mg/ml Ab stock을 1/50(~1/500)으로 dilution해서 사용. With PBS.
Para film으로 밀봉해서 dry되지 않도록 한다.
X. PBS washing 5min, 3times.
XI. secondary Ab 처리. 30min, R.T.
biotin이 달려있는 Ab를 사용. 농도는 보통 1:500.
XII. PBS washig, 5min, 3times
XIII. Streptavidin Peroxidase (1:500?)처리. 10min, R.T
(HRP)-àDAKO꺼.
XIV. PBS washing 5min, 3times.
XV. DAB 처리 10min, dark condition
Imidazole buffer( H2O2 포함.) 1ml
Chromogen (color reaction) 한 방울.
XVI. Running water로 washing. àPBS로 washing àD.W washing.
àHematoxylin & eosin staining.
1. Hematoxylin staining (핵 염색). 1min
2. running water로 washing —àPBS로 washing—à running water로 washing
3. mounting
http://www.vectorlabs.com/index.htm
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