Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol.95, pp. 1224-1229, February 1998 Microbiology

 

PCR analysis of tissue samples

 

1.       Tissue samples: the formalin-fixed samples

2.       DNA Extraction from Tissues.

▶ If the samples were embedded in small paraffin blocks

A. 각 block sample을 sterile scalpel blade로 잘라서 single &thin shavings을 얻는다. 각각을 sterile 1.5-ml microcentrifuge tubes에 준비.

B.      각 tube에 xylene 1ml을 넣어  paraffin이 침투 되어있던 tissue를 extraction할 수 있다.  paraffin이 용해될 때 까지 Room temp의 rocking shaker에 incubation.

C.  Centrifugation at 12,000 X g, 2min, solvent를 제거하고 pellet을 얻는다.

☞여전히 paraffin이 남아있으면 xylene extraction을 되풀이한다.

D.  0.5ml ice-cold 100% ethyl alcohol로 inverting하여 wash.

E.  2min, 12,000X g centrifugation. Ethyl alcohol을 제거한다

F   10㎕ acetone으로 pellets을 suspension.

G.  55 ⁰C에서 air-dry시켜준다

H.  Dried samples을 150 ㎕ freshly prepared solution에 suspension하여 37⁰C에서 overnight incubation시킨다.

I.  15sec, 12,000Xg centrifugation.

J.       Supernant를 95⁰C, 10min incubation.(proteinase를 inactivation)

K.      2min, 12,000Xg centrifugation.

L.      Supernant를 -20⁰C에 보관

 

 

▶If the samples were just fixed with  formalin

D.      tissue를 D.W로 wash해준다.

E.      Kidney, liver같은 whole Tissue는 잘게 잘라준다.

F.       0.5ml ice-cold 100% ethyl alcohol로10min 정도 inverting하여 wash.

G.      5min, 12,000X g centrifugation. Ethyl alcohol을 제거한다.

H.      200㎕ acetone으로 pellets을 suspension.

I.        55 ⁰C에서 air-dry시켜준다.

J.       Dried samples을 200 ㎕ freshly prepared solution에 suspension하여 37⁰C에서 overnight incubation시킨다.

 

 

Solution preparation

Components	Stock	200㎕
50mM Tris-HCl(pH8.5)	1M (pH8.5)	10㎕
1mM EDTA	0.2M	1㎕
0.1% Tween-20	10%(40C,2ndAb box에)	2㎕
Proteinase K (20mg/ml)	10mg/ml	200㎕

 

 

K.  15sec,12,000Xg centrifugation.

L.      Supernant를 95⁰C, 10min incubation.(proteinase를 inactivation)

M.5min,12,000Xg centrifugation.

N.Supernant를 -20⁰C에 보관