[안영하] 조직_표본_제작_procedure

조직 표본 제작 procedure (H&E)

                         1/31/01 by young-ha

 

1.     mouse autopsy(부검,↔생검:biopsy)

2.     gross appearance(육안적 관찰–장기의 외부를 관찰)

3.     Sampling

필요한 조직들을 고정.(With 10% formalin)

2일 이상fixation 시켜 놓는 게 좋다.  3~7days가 적당.

4.     Trimming(세밀하게 절단)

실험에 따라 원하는 면을 절단한 후,cassette에 넣고 10% formalin에 담궈 놓는다.. Thyroid 같은 작은 sample은 거즈에 싸서 cassette에 넣는다.

5.     수돗물로 washing .

   비이커에 cassette를 담아 흐르는 수돗물로 30분 이상 ~1시간.

6.     Automatic processor: paraffin침투, O/N

7.     Embedding – paraffin block 제작.

§ Embedding center 사용.

1.       ring에 연필로 labeling

2.       horcep은 계속 알코올램프로 달구어 굳지 않게 해준다.

3.       mold에 paraffin이 찰랑거리도록 채운다.

4.       조직의 넓은 면이 나오게 조직을 심는다.(실험 목적에 따라)

5.       Cold plate쪽으로 밀어준 후 바로 horcep으로 약간 눌러준다.

6.       그 위에 ring을 올려놓는다. Paraffin이 굳지 않았을떄…

7.       다른 block하나를 만들 동안 paraffin이 굳으면 그 위에 paraffin을 찰랑거리게 부어준다.

8.       paraffin을 4⁰ C cold plate에서 굳힌 후 -20⁰C에 30min 이상 넣어두면 block이 mold에서 잘 떨어져 나온다.

8.     paraffin section제작

1.       microtome을 이용해서 조직을 얇게 깎는다.

   5-3㎛ 두께로 slice 제작. block은 항상 꽁꽁 얼린 ice에 올려  

   놓는다.

2.       만들어진 slice를 40% 알코올에 띄운다.

3.       40⁰ C로 setting된 D.W에 띄운다.(주름이 펴진다. 그러나 너무 오래 두면 조직이 갈라진다.)

4.       slide에 이름(명칭) 및 날짜 등을 표기한다.

5.       slide에 sample을 올려서 건져낸다.

6.       60⁰ C Dry oven에서 약 30이상 둔다.(o/n도 무관)

9. Harris Hematoxyline & Eosin staining`

 

      1.xylene I, II, III,IV………………………>5min respectively

      2.Aceton……………………………..2~3times dipping

      3.100% EtOH……………………….5~6times dipping

      4. 95% EtOH…………………………     〃             

      5. 90% EtOH…………………………     〃            

      6. 80% EtOH…………………………     〃

      7.70% EtOH…………………………     〃 (3.~7. : Dehydration step)

    8.tap water and DDW washing……..     〃

    9.Hematoxyline staining…………….    10min

10.tap water and DDW washing………

(흐르는 수돗물로 충분히 Hematoxyline을 제거해주도록 할 것)

11. 1% HCl………………………………     1sec. 

(과도한 염색을 제거하기 위함. 한 번만 담글 것)              
              

12. tap water washing………………….    10min              

(원래 Ammonia로 중화 시켜야 하나 수돗물로 충분히 중화 시키도록 할 것)

13. DW washing……………………….5~6 times dipping     (11. ~ 13. 생략가능)

14. Eosin staining………………………     20sec.

(색깔을 보아가며 시간을 조정하여 진하기를 조정하도록 한다.)

15. tap water and DDW washing ……….

(흐르는 수돗물로 충분히 Eosin을 제거해주도록 할 것)

16. 70→80→90→95→100% EtOH… 5~6 times dipping

17. Xylene I, II ,III, IV………………>5min  respectively

18. Mounting ; xylene에 담겨있는 slide를 꺼내서 (마르기 전에)

         sample위에 송진– mouting 액을 떨어뜨린다. 그 위에

         cover glass를 덮는다. (공기 방울이 안 들어가도록 천천히)