[mouse work] Perfusion

l  Perfusion

 

-Material              

mouse : BL21/B6 (8weeks)

media : DMEM or F-12(Gibco BRL)

hormone : secretin, CCK, Dexametasone

 

1.     DMEM or F-12 media에 각 hormone을 적당 농도로 dilution 한다.

(secretin : 5nM,  CCK : 0.025u/ml,  Dexametasone : 100nM)

media의 양은 mouse 무게의 70%로 한다.

즉 mouse가 30g이면 21ml을 준비한다.

2.     mouse를 마취시킨다.

3.     mouse의 배쪽에서 가슴뼈지점의 skin을 먼저 자른다.

4.     가슴뼈 바로 위를 자른 후 늑골의 양쪽을 V자 모양으로 자른다.

5.     hemostatic scissor로 자른 부분을 고정하고 pump와 연결되어 있는 주사바늘을 심장의 좌심실에 주입한다.

이때 22G needle을 사용한다.

6.     pump(Bio-Rad)를 통해서 7ml~8ml/min.의 속도로 media를 주입한다.

먼저 control(hormone이 없는 media)부터 시작하고 나머지 hormone이 들어있는 media를 주입한다.

7.     media의 주입으로 심장이 부풀어 오르기 시작하면 심장의 우심방과 연결되어있는 대정맥을 절단한다. 그러면 혈액이 모두 흘러나오고 주입된 media가 몸 속을 모두 순환한 후 밖으로 빠져 나오게 된다.

8.     media가 모두 주입되면 곧바로 장기를 꺼내서 pre-incubation(37◦C)된 500μl의 serum free media에 넣고 뚜껑을 open 상태로 CO2 incubator에서 1시간동안 incubation을 한다.

9.     Incubation 후 장기를 제거하고 centrifuge를 한 후 media를 vivaspin(Viva science)을 이용하여 농축한다.

10.  western blotting을 통해 secretion이 된 것을 확인하다.

 

l  주의: mouse가 살아있는 상태에서 실험이 진행되어야 perfusion이 가능하다.

         심장이 멈추면 perfusion이 불가능함!!