[mouse work] PCR analysis of paraffin embedded tissue

PCR analysis of paraffin embedded tissue

1.xylene I, II, III, IV………………………..  >5min respectively (dewaxing)

2.Aceton…………………………………….  2~3times dipping

3.70→80→90→95→100% EtOH……….   각기 10min. (rehydration)

4. Running tap water washing……………   10min

5. D.W I…………………………………..    5min

6.D.W II………………………………….    5min

7.D.W III…………………………………   >10min.

8. Scratching and transfer into E.tube. ; 6 tissue slice를 칼로 긁어서 얻는다.

9.mix in 1% SDS solution (total 50㎕) and add proteinase K(final concentration 400㎍/ml)

	Stock	Working	50㎕      100㎕
SDS	10% SDS	1% SDS	5㎕       10㎕
Proteinase K	10mg/ml P.K	400㎍/ml	2.5㎕     5㎕
D.W			42.5㎕  85㎕

10.incubate in 48⁰C, overnight

11.Add proteinase K(final concentration 400㎍/ml) and incubate in 48⁰C, overnight

12.tissue가 완전히 녹은 것을 눈으로 확인한다.

13.purify with Phenol/chloroform (Amresco)

  :DNA양이 적은 관계로 chloroform :isoamylalcohol(24:1) 이 phenol보다 2배가 되도록 더 추가한다. 그리고 DNA solution양의 1/2이 되도록 Phenol/chloroform을 넣는다……..vortex.

14. Centrifuge at 12,000 rpm for 5min

15.Collect the Supernant and add chloroform: isoamylalcohol(양은 Supernant양의 1/2)…vortex

16.Centrifuge at 12,000rpm for 5min

17.Collect the Supernant

18.Add 1/10 volume 3M sodium acetate and 2 volumes 100%EtOH

19.Incubate at -70⁰C for 1hour~

20. Centrifuge at 12,000rpm for 15min

21.Discard and washing with 70% EtOH

22.Centrifuge at 12,000rpm for 10min.

23.Dry

24.Resuspend with 20㎕ TE buffer.

25.PCR(경험상 ㎕당 25~100ng정도 되므로 양을 잴 것 없이 바로 PCR한다.)

 

주의사항

조직이 완전히 녹은 것을 확인한다.

조직의 양에 따라 마지막에 녹이는 양을 조절한다.