[mouse work] The_Isolation_of_Mouse_Genomic_DNA

Isolation protocol for Genomic DNA

mouse tail cutting한 후, 그 날 PK를 처리하지 않을 경우 –20’C, -70°C에 저장.

1.      꼬리가 든 E-tube에 PK treatment: TES(500ml)+PK(100~200mg=20ml )/tail 1cm ,55°C, O/N (4시간 이상 반응 시킨다)

*PK농도는 sample종류에 따라 조절

*60°C 이상시 PK가 파괴되므로 절대 넘지 않도록, Water bath는 미리 55°C로 setting해놓는다. PK는 녹여서 잘 shaking한 후에 사용한다

*TESsms Autoclave 해주고 0.2mm filtering한다.

*PK는 –20’C에서 보관

2.      완전히 녹은 꼬리가 든 E-tube에 PCIA(phenol:CIA=1:1)을 500ml.(PCIA=Amerscom.)넣고 15분간 (5분도 O.K.) inverting한다. (뿌옇게 될 때까지)이때 너무 많이 세게 흔들면 DNA가 깨지므로 주의한다.

3.      14000rpm에서 10분간 centrifugation.

4.       blue tip 끝을 가위로 0.3cm 정도 잘라 낸 것으로 상층액을 350㎕ 따서 새 E.tube로 옮긴다. (*이때의 가위는 alcohol or fire로 멸균한다.)

5.      8M ammonium acetate,150㎕를 넣는다.

6.      5번의 E.tube에 100%  ethanol 800㎕를 넣고 15~20회 정도 뒤집으며 섞어준 후, 상온에서 30분(O/N가능)간 둔다. *이때 하얀 실타래 같은 DNA가 보인다.

7.      14000rpm에서 10분간 원심분리. 이때 tube 바닥에 pellet이 보여야 한다.

8.      pellet을 건들이지 않게 조심하며 에탄올 제거.

9.      70% 에탄올 500㎕를 넣고 바로 14,000rpm에서 5분간 centrifuge함.(*70% EtOH처리시에는 신속하게 작업한다. 이유는 DNA가 녹아버린다.)

10.    공기 중에서 tube 뚜껑을 열어 놓은 채로 pellet을 말린다.(*clean bench안에서 UV끄고!!!)

11.    D.W 200㎕에 DNA pellet을 녹인다.

à (DNA양에 따라서 조절한다)

3rd DDW를 쓰고 autoclave와 filtering한다.

         DNA양이 적어 보일 때는 100ul만 넣는다/

         4’C에 보관.