ARS Secretion Test Protocol

1.      transfection 전날 cell seeding

2.      cell density가 60~80%정도가 되면 transfection 시작한다.

3.      6-well plate의 경우 2㎍의 DNA를 0.5㎖의 serum free media(no Antibiotics)에 희석한다

4.      2㎍*5=10㎕ GenePORTER reagent( vortex the reagent before use)를 0.5㎖l의 serum free media에 희석한다.

5.      3번과 4번의 solution을 30초간 voltexing하여 빠르게 섞은 뒤, 30분간 room temp.에서 incubation 한다.

6.      2번 cell culture plate의 media를 깨끗이 제거한다.

7.      serum free media로 2번 wash한다.

8.      cell culture plate에 5번의 media를 조심하게 넣은 뒤 37’C incubator에서 4시간동안 키운다

9.      20% FBS가 포함된 media를 1㎖ add 한다

10.  20시간 동안 incubation 한다.

11.  cell culture plate를 serum free media로 두 번 정도 조심하게 wash한다. serum free media를 1㎖을 넣고 5시간동안 incubation 한다.

12.  medium: 조심하게 collect 한 후 14000rpm에서 3분간 centrifugation한 뒤
                                    
cell pellet을 다치지 않게 조심스럽게 medium만 따서 vivaspin에 넣고                     
 
2000rpm 으로 centrifugation하여 concentration 시킨다.

OR : pure EtOH를 동일 volume넣어 50% EtOH상태가 되도록 하고,

-20’C에서 O/N or –70’C에서 30분간 incubation하여 13000rpm에서

10분간 centrifugation하여 pellet을 모으고, 2X sample buffer 50ul넣고 boiling 한다.

cell: cold PBS로 wash한 후 harvest à pelleting

    50㎕ lysis buffer를 넣고 sonication한다

13.  SDS-PAGE

Cell lysate: 30㎍/lane

Medium: all

14.  anti-c-myc(1:1000)(Santa Cruze)으로 western