[cell biology work] 293_or_other_cell_passing

293 or other cell passing

04/28/01 by young-ha

 

I. Media(DMEM)에 serum을 넣을 때,

i)    media, FBS(Fetal Bovine Serum:GIBCOBRL#26140-079;50ml conical tube에 aliquot해놓은 것)——à 37 ⁰C, 10min stand.

Trypsin- EDTA (GIBCO#25300-054) & penicillin-streptomycin (GIBCO#15140-122)

——-àR.T, 10min

ii)  먼저 penicillin-streptomycin을 5ml(1%)을 넣고,

 iii) FBS 50ml(10%)를 넣는다.

 iv) bottle을 gently흔들어준다.

*이렇게 하면 pippet 한 개로 사용 가능

*뚜껑은 손으로 잡고 해야 하며 뚜껑위로 손이 지나다니면 안됨.

 

II. 보통 cell을 passing할 때,

i)  confluent cell을 new tip으로 suction해서 discard

*1XPBS 10ml로 washing해준다.

  ii) tripsin-EDTA 2ml을 고루고루 똑똑 떨어뜨린다.(팍 쏘면 cell이 확 떨어져버림)

iii) gently흔들어준 후, 다시 suction해서 discard.(293 cell은 잘 떨어짐.)

   cf. tripsin-EDTA처리 후에 37 ⁰C incubator에 3min 둔 후 suction    

     해야 떨어진다.

iv) 미리 새로운 100파이 dish에 11ml의 media를 aliquot해준다.

v) suction후 5ml의 media를 넣고 17~20 정도 pippet으로 up & down해주어야

    cell이 single로 떨어진다.

  vi) 5ml중 1ml(1/5 dilution)만 새 media에 골고루 떨어뜨려준다.

vii) dish를 gently잘 흔들어준 후, 현미경으로 cell이 single로 잘 떨어졌는지 본다.

 

 

Transfection of DNA into Mammalian cells (293 cell) with GenePOTER Reagent

 

1.  confluent cell을 6-well or 35파이(sample 개수가 작을 때)로 하루 전에 split 해놓는다.

 Transfection 하는 당일 날 60-70% confluent해지도록 한다.

i)                    100파이에 있는 cell을 10ml PBS로 washing해준 후,  Trypsin-EDTA 3ml로 cell을 떼어낸다. 3min incubation후에 5ml media로 resuspension 해준다.(18번 up & down해준다. )

ii)                  35파이 dish와 100파이 dish(실험에 따라 조정)에 미리 2ml media를 aliquot해둔다.

iii)                35파이에suspension된 cell을 한 방울 떨어뜨린 후 microscope으로 cell이 너무 작은 경우 , 확인 후 한 방울을 더 떨어뜨려도 좋다. 그러나 293 cell같은 경우 빨리 자라므로 되도록 조금만 깐다.

iv)                dish가 작아서 cell들이 중앙에만 모여서 자랄 수가 있다.

—-8자를 그리며 4번 돌려주고, 90도 회전시켜서 다시 8자를 그리는 거 4번..

             이런 식으로 총 4번을 한다.

v)                  나머지 100파이에 1ml정도 똑똑 떨어뜨려서 keeping한다.

2.  Cell을 하루 동안 키워서 60-70% confluence가 되도록 한다.

3.  Transfect gene

I)