[molecular biology work] purification_of_YRS

Purification of YRS using Ni⁺⁺  column

1.       6ml 의 LB/kan 에 overnight culture 후 800ml 의 LB/kan 에 1/200의 volume 으로 접종한 다음 30 degree 에서 O.D 0.3 이 될 때까지 culture 한다.

2.       0.1mM 의 IPTG를 넣어 3시간 동안 induction 하였다.  Cell 을 시킨 다음 사용시까지 –70 degree 에 보관.

3.       Cell을 g당 8ml 의 buffer A(20mM KH2PO4, 500mM NaCl, pH 7.8, 2mM b-mercaptoethanol) 에 resuspension 하여 ultra-sonicator(fisher)를 이용하여 15초씩 1분 간격으로30회sonication한다.

4.       Cell lysate 를 4 degree, 26,000Xg 에서 45분간 centrifugation 을 한 다음 supernatant 를 0.45 um 로 filtering 을 한 다음 buffer B(20mM KH2PO4, 500mM NaCl, pH 6.0, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol)로 equilibration 된 Ni++ 에 loading 하여 5분간 inverting을 하여 binding 시킨다.

5.       10배 bed volume의 Buffer A 로 inverting으로 washing  한 다음 20 배 bed volume의 buffer B로 washing 한다.

6.       50mM Tris-HCl, pH 8.3, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol 를 column에 5 bed volume을 흘려 보냄으로써 buffer exchange를 한다.

7.       50mM Tris-HCl, 250mM L- Histidine, pH 8.3, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol 을 이용하여 elution 한다.

8.       SDS_PAGE를 통해 purity를 확인하고 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol 로 viva spin을 이용하여 buffer를 바꾼다.

Purification of YRS using FPLC

     1. 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol 로 equilibration 된 mono Q에 0.5ml/min으로 흘려 binding 시킨다음 50mM Tris-HCl, 500mM NaCl, pH 7.5, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol 로 20ml의 gradient 를 걸어준다. Fraction은 0.4ml씩 받는다. SDS_PAGE를 통해 pure 한 부분만의 fraction 을 모아 50mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 2mM b-mercaptoethanol 로 buffer 를 치환하고 여기에 50%의 glycerol 을 넣어 –70 degree에 보관한다.